揭示蛋黃抗體的研究結(jié)果

    高免蛋黃抗體具有過程簡單、效率高等特點，已越來越多地應(yīng)用于人類許多疾病的預(yù)防和治療以及生物學(xué)的高度特異性檢測等領(lǐng)域中，并取得顯著成效。本文主要研究了以人致病性大腸桿菌為抗原，免疫母雞，研究獲得含有價蛋黃抗體的雞蛋的*條件；建立快速、準確、定量的酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定蛋黃抗體（IgY）效價的技術(shù)；研究抗人大腸桿菌IgY分離純化條件及其理化、生化特性；研究食品加工過程中的各種因素對大腸桿菌特異IgY生物活性的影響；探討抗人大腸桿菌免疫雞蛋抗體的功能及其機理；評估蛋黃抗體的安全性。

主要獲得如下結(jié)果：

    （） 對獲得含有價蛋黃抗體的雞蛋的*條件研究發(fā)現(xiàn)：（a） 以大腸桿菌懸浮液對20周齡京白蛋雞免疫時，若固定免疫抗原劑量為0.5ml，則當(dāng)菌液濃度低于×0~9 cfu／ml，免疫應(yīng)答強度隨免疫劑量的降低而降低，當(dāng)菌液濃度高于×0~9 cfu／ml時，免疫應(yīng)答強度不會隨免疫劑量的增加而得到明顯加強。因此，確定*免疫劑量為每次0.5ml菌液濃度為×0~9 cfu／ml的大腸桿菌懸浮液。

    （b） 在大腸桿菌懸液中添加等量的福氏*佐劑、福氏不*佐劑和白油佐劑能明顯加強免疫應(yīng)答強度，其中福氏*佐劑對免疫應(yīng)答加強的程度zui高。

    （c） 胸部皮下注射、翅下皮下注射、大腿皮下注射、頸背皮下注射、胸部肌肉注射、翅下肌肉注射、大腿肌肉注射和頸背肌肉注射8種不同免疫途徑對免疫應(yīng)答反應(yīng)強度沒有明顯影響。

    （d） 強化免疫程序能大大加強產(chǎn)蛋母雞的免疫應(yīng)答強度，其中初免后，每隔周強化免疫一次，連續(xù)4次，此后每月僅用佐劑抗原強化免疫次的強化免疫程序既經(jīng)濟又有效。

    （2） 采取熱酚法提取E.coli LPS作為抗原，以酶標記的兔抗雞IgY抗抗體（IgG）為二抗建立起來的間接ELISA技術(shù)檢測特異蛋黃抗體IgY的抗體效價，以酶標二抗工作濃度為：2000，LPS抗原包被濃度為：20（0ug／ml），可以檢測到雞特異IgY抗體效價為：0240。用豬源EHEC和人源沙門氏菌的LPS抗原進行了交叉檢測，表現(xiàn)出高度的特異性。

    （3） 通過對蛋黃抗體（IgY）的分離純化條件研究發(fā)現(xiàn)，乙醇沉淀抗體的*條件是粗提液：乙醇（V／V）為：0.35；經(jīng)DEAE-Sephrose fast-flow離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠排阻層析連續(xù)純化后可得到電泳純的抗人大腸桿菌IgY，其MW為86400Da（電泳法）或86500Da（凝膠過濾法），該抗體由兩個亞基構(gòu)成，分子質(zhì)量分別為65900Da和24600Da，其等電點為5.5。

    （4） 通過穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)： （a） 抗人大腸桿菌IgY抗體在高溫下（≥75℃）容易發(fā)生熱變性，其熱變性的反應(yīng)級數(shù)為.5，其熱變性溫度點為75.0℃。

    （b）抗人大腸桿菌抗體在酸性環(huán)境容易發(fā)生變性，而在中性和弱堿性環(huán)境中能較好的保 持穩(wěn)定，其主要變性發(fā)生在pH2.5一3.0。

    （c）、和對抗人大腸桿菌抗體的活性保持均有不利的作 用，但發(fā)現(xiàn)，經(jīng)上述3種消化道蛋白質(zhì)水解酶部分作用后形成的抗體水解物仍具有一定的抗 體活性。進一步研究確定，在灌胃后lh內(nèi)，小腸內(nèi)抗體活性基本保持在zui高水平，而在Zh 之后，抗體活性大幅度下降，在灌胃后6h已經(jīng)下降到了非常低的水平。

    （d）將抗人大腸桿菌抗體貯存在O℃和4℃是比較合適的，若貯存在25℃以上的溫度下， 抗體活性損失隨貯存期的延長而不斷下降。

    （e）加熱處理、蛋白酶處理以及冷凍干燥處理對抗體的活性都有不利的影響，但一定濃 度的乳糖、環(huán)糊精和糊精能加強抗體對熱處理和蛋白酶處理的穩(wěn)定性，而環(huán)糊精、乳糖、糊 精、果糖、葡萄糖、和甘油都能不同程度的加強抗體在冷凍干燥過程中的穩(wěn)定性。

    （5）通過對抗人大腸桿菌免疫蛋黃抗體的功能及其機理探討發(fā)現(xiàn)，抗人人腸桿菌卵黃抗體 濃度大于sm留ml，可對大腸桿菌有明顯的體外抑菌作用;抗人大腸桿菌IgY對大腸桿菌誘導(dǎo) 的乳鼠腸道感染具有顯著的預(yù)防和治療作用;抗人大腸桿菌卵黃抗體可抑制大腸桿菌對腸上 皮細胞粘附作用，隨著大腸桿菌濃度的不斷升高，粘附率不斷增加，上皮細胞濃度的增加能 提高ETEC對其的粘附率。

    （6）研究發(fā)現(xiàn)，4.0 kGy的“。c。丫射線可使蛋中可能污染的微生物全部滅活，而不影響 抗體活性;雞抗人大腸桿菌抗體對臨床檢查、血液學(xué)、生化學(xué)、器官重量、系數(shù)及組織病理 學(xué)等指標無明顯影響，證明雞蛋黃抗體IgY無急、‘漫性毒副作用:通過骨髓嗜染紅細胞微核 試驗、小鼠精子畸形試驗及Ames試驗，結(jié)果證明雞抗人大腸桿菌抗體無細胞毒，無致突變作 用。