富集培養以后的樣品中目的微生物雖然已占了優勢，但其他微生物仍然存在。因此，為了獲得某一特定的微生物菌種，必須對富集培養后的樣品進行純化分離。ELISA試劑盒

()純種分離的基本方法純種分離通常采用稀釋法和畫線法。畫線法是用接種針挑取微生物樣品在固體培養基表面畫線，培養后獲得單菌落。畫線法簡便、快速，但所得到的單菌落不一定是純種。稀釋法是先將樣品經無菌水或生理鹽水稀釋后，再涂布到固體培養基上，培養后獲得單菌落。稀釋法使微生物樣品分散更加均勻，獲得純種的概率更大。

(2)通過控制營養和培養條件進行純種分離

①控制分離培養基中的營養成分不同微生物對碳源、氮源的需求不一樣。因此需要事先了解被分離微生物的營養要求，設計一種合理快速的分離培養基，這樣就能夠收到事半功倍的效果。例如以淀粉為碳源的培養基可鑒別菌落能否產生；以纖維素為碳源的培養基可鑒別菌落能否產生纖維素酶；以酪蛋白為氮源的培養基可鑒別菌落能否產生蛋白酶。

②控制培養基的pH值不同微生物對pH值的要求不同。細菌、放線菌的生長繁殖一般要求偏堿(pH7．0～7．5)的生長環境，而霉菌和酵母菌則要求偏酸(pH4．5～6．0)的生長環境。因此．配制分離培養基時應調節pH到被分離微生物的要求范圍，這樣既有利于所需菌種的生長．也可排除一部分不需要的菌種。例如分離檸檬酸產生菌時，調節培養基的pH到2．0～2．5，這樣有利于分離到產生檸檬酸的黑曲霉。又如分離堿性蛋白酶和堿性脂肪酶產生菌時，可以將培養基pH調到9～，能起到濃縮這些菌種的作用。

    培養基pH還要考慮其他成分。微生物在生長繁殖過程中，由于代謝作用，會產生酸和堿，使pH會發生變化。一般培養基C／N高，培養后傾向于酸性，反之則傾向于堿性。無機鹽的性質也會影響pH變化，如(NH 4)2 SO4是生理酸性氮源，NaNO3是生理堿性氮源。為了維持培養基的pH值，一般要加入磷酸鹽，使培養基具緩沖能力。如果培養基中的酸堿度變化很大，磷酸鹽的緩沖容量不足，則可加入適量碳酸鈣，以不斷中和菌體代謝過程中產生的酸類，使培養基的pH保持在恒定的范圍內。

③控制培養溫度各類微生物的生長溫度不同。根據微生物對生長溫度的需求不同，可將微生物分為三類：*類是嗜熱微生物．zui適溫度50～60℃；第二類為嗜溫微生物，zui適生長溫度是20～40℃；第三類是嗜冷微生物，zui適溫度為5℃以下。因此可控制培養溫度以獲得所需要的微生物。

④供氧條件的控制不同微生物對氧的需求不一樣，好氧菌要在有氧條件下培養，而厭氧菌則要在厭氧條件下才能生長。ELISA試劑盒

    分離厭氧菌．要采取厭氧培養法，培養過程中要除去氧氣?？稍诜蛛x培養基中加入還原劑．如半、D型、硫化鈉等，快速畫線后，立即置真空密封容器中(充二氧化碳或氮氣)；也可利用焦性沒食子酸和NaOH反應，除去氧氣。

(3)利用平皿的生化反應進行分離(圖2．35) 這是利用特殊的分離培養基對微生物進行初步分離的方法。分離培養基是根據目的微生物的特殊生理特性或其代謝產物的生化反應進行設計的。通過觀察微生物在特殊分離培養基上的生長情況或生化反應進行分離，可顯著提高目的微生物分離純化的效率。

①透明圈法在平板培養基中加入溶解性較差的底物，使培養基混濁。將含目的微生物的待分離樣品接種到此培養基中進行培養，能分解底物的微生物便會在菌落周圍產生透明圈，透明圈的大小可初步反映該菌株利用底物的能力。該法多用于分離水解酶產生菌，如以淀粉為碳源的培養基可鑒別菌落能否產生；以纖維素為碳源的培養基可鑒別菌落能否產生纖維素酶；以酪蛋白為氮源的培養基可鑒別菌落能否產生蛋白酶。根據菌落周圍形成的透明圈的有無和大小，可以大致確定酶活力的有無和強弱。

    產有機酸的微生物也可采用透明圈法進行分離。在分離培養基中加碳酸鈣，使之形成混濁狀，把土樣懸浮液涂到平板上，如在培養過程中產酸，則能把菌落四周的碳酸鈣水解，形成清晰的透明圈。

②變色圈法在分離培養基中加入指示劑或顯色劑，可使所需微生物能被鑒別出來。如分離產生菌時．在培養基中加入溴百里酚藍，它是一種酸堿指示劑，變色范圍在pH6．2～7．6，當pH6．2以下時為黃色，當pH7．6以上時為藍色。若平板上出現產酸菌，其菌落周圍會變成黃色，可挑取黃色菌落，進一步篩選產生菌。

    分離降脂微生物的常用方法是把維多利亞蘭和脂類混合，制成瓊脂培養基平板，起始pH調為中性，將土樣懸浮液分離在平板上，具有降脂能力的菌落產生脂酶，水解脂類底物，使pH由中性下降到酸性，即陽性降脂反應能顯示粉紅色到藍色的變化。若起始pH為
堿性．則陽性降脂反應從咖啡色變成藍綠色，能使脂類底物與降脂后的脂肪酸區別開來。

    分離蛋白酶產生菌時．除可用酪蛋白作底物，觀察菌落周圍有無透明圈外，還可以吲羥乙酸酯為底物，能產生堿性蛋白酶的芽胞桿菌菌落，由于水解吲羥乙酸酯而產生3一羥基吲哚，后者能氧化產生藍色產物，以此鑒別菌落是否產蛋白酶。

③生長圈法生長圈法通常用于分離和篩選產生氨基酸、核苷酸和維生素的微生物。所用工具菌是一些相對應的營養缺陷型菌株。將待分離菌株涂布于含高濃度的工具菌并缺少所需營養物的平板上進行培養，則在能合成該營養物的菌落周圍會產生一個混濁的生長圈。

④抑菌圈法抑菌圈法常用于分離和篩選產生抗生素的微生物。所用工具菌為抗生素的敏感菌。若被分離微生物能產生某種抗生素．便會在該菌落周圍形成工具菌不能生長的抑菌圉。ELISA試劑盒

    利用抑菌圈法還能篩選產生某些酶類的微生物。如可利用抑菌圈法篩選酰化酶產生菌。工具菌為一種對芐抗性而對6一氨基青霉烷酸(6一APA)敏感的黏性沙雷氏菌。這種菌只有當芐青霉索尚未被?；皋D化為6一APA時才能生長。具體做法是將工具菌和芐混合于平板培養基中，將待分離菌涂布于平皿上培養．凡菌落周圍出現抑菌圈的即為酰化酶產生菌。