兔外周血巨噬細胞

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細胞形態(tài) 巨噬細胞樣

傳代特性 屬于終末分化細胞；屬于不增殖細胞群

消化液 利多ka因（12mM）

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

兔外周血巨噬分離自外周血；外周血是除骨髓之外的血液，臨床上常用一些方法把骨髓中的造血干細胞釋放到血液中，再在從血液中提取分離得到造血干細胞，我們把這樣得到的干細胞稱為外周血干細胞，在二十一世紀初人類開始的生命方舟計劃中提出外周血這一新概念。巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學的重要對象。巨噬細胞較易獲得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2-3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長期生存。巨噬細胞（Macrophages）是一種位于組織內的白血球，源自單核細胞，而單核細胞又來源于骨髓中的前體細胞。巨噬細胞和單核細胞皆為吞噬細胞，在脊椎動物體內參與非特異性防衛(wèi)（先天性免疫）和特異性防衛(wèi)（細胞免疫）。它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫細胞，令其對病原體作出反應。
方法簡介：

公司實驗室分離的兔外周血巨噬采用取外周血、通過密度梯度離心法、差速貼壁、細胞因子誘導法制備而來，細胞總量約為5×10?cells/瓶。
質量檢測：

公司實驗室分離的兔外周血巨噬經(jīng)CD68免疫熒光鑒定，純度可達90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細菌、酵母和真菌等。

一、細胞培養(yǎng)

1取材 在無菌環(huán)境下從機體取出某種組織細胞（視實驗目的而定），經(jīng)過一定的處理（如消化分散細胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過程稱為取材。如是細胞株的擴大培養(yǎng)則無取材這一過程。機體取出的組織細胞的培養(yǎng)稱為原代培養(yǎng)。2培養(yǎng) 將取得的組織細胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。3凍存及復蘇（可參閱后面有關章節(jié)）為了保存細胞，特別是不易獲得的突變型細胞或細胞株，要將細胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度－196℃，將細胞收集至凍存管中加入含保護劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細胞保存的時間幾乎是無限的。復蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內迅速融解。然后將細胞轉入培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng)。

二、原代細胞分離

凡是來源于胚胎、組織器官及外周血，經(jīng)特殊分離方法制備而來的原初培養(yǎng)的細胞稱之為原代細胞。1懸浮細胞的分離方法組織材料若來自血液、羊水、胸水或腹水的懸液材料，的方法是采用1000r/min的低速離心10分鐘。經(jīng)離心后由于各種細胞的比重不同可在分層液中形成不同層，這樣可根據(jù)需要收獲目的細胞。2實體組織材料的分離方法對于實體組織材料，由于細胞間結合緊密，為了使組織中的細胞充分分散，形成細胞懸液，可采用機械分散法（物理裂解）和消化分離法。

三、細胞增殖檢測技術

目前主要有兩種用于檢測細胞增殖能力的方法。一種是直接的方法，通過直接測定進行分裂

的細胞數(shù)來評價細胞的增殖能力。另一種是間接的方法，即細胞活力（cell viability）檢測方法，通過檢測樣品中健康細胞的數(shù)目來評價細胞的增殖能力。顯然，細胞活力檢測法并不能最終證明檢測樣品中的細胞是否在增殖。如細胞在某一培養(yǎng)條件下會自發(fā)啟動凋亡程序，但藥物的干擾可抑制凋亡的發(fā)生；這時若采用細胞活力檢測法，顯然可以區(qū)分兩種條件下的細胞數(shù)量，但我們并不能從藥物干擾組細胞數(shù)大于對照組的事實說明藥物可促進細胞增殖的結論。所以最直接的證據(jù)應該采用方法一。

取材：首先，用培養(yǎng)液濕潤所取的組織材料，并用鋒利的眼科剪去除附在其上的脂肪和結締組織。接著用平衡液（如PBS或Hanks液）漂洗，再用眼科彎剪將組織塊剪成小塊。多次用PBS或Hanks液漂洗，直到液體清亮、無油滴為止。

接種：用濕潤的吸管吸取切碎的組織塊，輕輕吹到培養(yǎng)瓶皿中，并按一定間距均勻放在培養(yǎng)瓶底壁上。注意不要過多，確保組織塊切面貼在培養(yǎng)瓶底壁上。

培養(yǎng)：將培養(yǎng)瓶翻轉，使瓶底朝上，在種植了組織塊一側的對側面加足培養(yǎng)液，避免組織塊與培養(yǎng)液接觸，然后塞緊瓶塞。將種植了組織塊的一側朝上，靜置于37℃培養(yǎng)箱中。待組織塊貼壁1到3小時后翻瓶，使貼壁的組織塊浸沒在培養(yǎng)液中，繼續(xù)靜置。換液：每隔2到3天更換一次培養(yǎng)液，或者根據(jù)培養(yǎng)瓶種顏色的變化確定換液時間。

一、原代細胞計數(shù)

將血球計數(shù)板及蓋片用擦試干凈，并將蓋片蓋在計數(shù)板上。

將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數(shù)板之間。

靜置3分鐘。

鏡下觀察，計算計數(shù)板四大格細胞總數(shù)，壓線細胞只計左側和上方的。然后按下式計算：

細胞數(shù)/ml＝4大格細胞總數(shù)/ 4×10000

注意：鏡下偶見由兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算，若細胞團占10%以上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。

二、原代細胞活力

將細胞懸液以0.5ml加入試管中。

加入0.5ml 0.4%臺盼蘭染液，染色2一3分鐘。

吸取少許懸液涂于載玻片上，加上蓋片。

鏡下取幾個任意視野分別計死細胞和活細胞數(shù)，計細胞活力。

死細胞能被臺盼蘭染上色，鏡下可見深蘭色的細胞，活細胞不被染色，鏡下呈無色透明狀。

活力測定可以和細胞計數(shù)合起來進行，但要考慮到染液對原細胞懸液的加倍稀釋作用。