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人外周血單個核分離自外周血；外周血是除骨髓之外的血液，臨床上常用一些方法把骨髓中的造血干細(xì)胞釋放到血液中，再在從血液中提取分離得到造血干細(xì)胞，我們把這樣得到的干細(xì)胞稱為外周血干細(xì)胞，在二十一世紀(jì)初人類開始的生命方舟計劃中提出外周血這一新概念。外周血單個核細(xì)胞(PBMC)即外周血中具有單個核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。目前，主要的分離方法是密度梯度離心法，因為血液中各有形成分的比重存在差異，因此得以分離出不同的細(xì)胞。
方法簡介：

公司實驗室分離的人外周血單個核采用取外周血、通過密度梯度離心法制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實驗室分離的人外周血單個核經(jīng)過檢測，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

培養(yǎng)基 含FBS、生長添加劑、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 半貼半懸浮

細(xì)胞形態(tài) 圓形

傳代特性 不增殖；不傳代

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準(zhǔn)備工作

1. 實驗器材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備無菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術(shù)器械等，并進(jìn)行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準(zhǔn)備：配制或購買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無菌且在有效期內(nèi)。

3. 實驗動物或組織來源準(zhǔn)備：根據(jù)實驗需求，選擇合適的動物并進(jìn)行相應(yīng)的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無菌條件下，迅速取出目標(biāo)組織，盡量減少對組織的損傷，并去除多余的脂肪、結(jié)締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預(yù)冷的無菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質(zhì)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細(xì)胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫?fù)u床或培養(yǎng)箱中消化一段時間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當(dāng)組織塊大部分被消化成單細(xì)胞懸液或小細(xì)胞團(tuán)時，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過濾與離心：用細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心，收集細(xì)胞沉淀。

細(xì)胞觀察與檢測

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)、密度等，記錄細(xì)胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染或異常，及時采取相應(yīng)措施。
2. 細(xì)胞計數(shù)與活力檢測：在需要時，可采用臺盼藍(lán)染色等方法對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)和活力檢測，以了解細(xì)胞的生長情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長時間暴露于室溫或非營養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質(zhì)。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

- 消化時間需嚴(yán)格控制（通常 10-30 分鐘），可通過顯微鏡觀察細(xì)胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細(xì)胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細(xì)胞適應(yīng)壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細(xì)胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時密度建議控制在 70%-80%，過度匯合會導(dǎo)致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無菌操作

- 全程在超凈臺操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長期使用可能影響細(xì)胞活性。

2. 支原體檢測

- 定期檢測支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時丟棄細(xì)胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細(xì)胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細(xì)胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細(xì)胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時凍存早期代次細(xì)胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或?qū)Ｓ脙龃媾囵B(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。